刘辉旺12刘自逵张云露3李想12郭必坤12
（1PSY应用研究院2湖南加农正和生物技术有限公司3湖南农业大学）
摘要：选用6周龄、体重一致、未经产的健康成熟雌性昆明小鼠只，随机分为4组，空白组饲喂基础日粮、低剂量试验组（基础日粮+0.2%康之源）、中剂量试验组（基础日粮+0.35%康之源）、高剂量试验组（基础日粮+0.5%康之源），连续饲喂28天，试验组0-21天按添加处理饲喂，从第22天起全部饲喂基础日粮，在试验开始第0、7、14、21、28天每个重复随机抽取2只小鼠处死采样，测定非特异性免疫指标，结果显示：试验组十二指肠SIgA、血清中溶菌酶、防御素、IFN-β、IL-4、IL-10等含量显著高于空白组（p0.05），试验组血清中IL-1、TNF-α含量显著低于空白组（p0.05），表明：中药康之源有效增强小白鼠非特异性免疫。
关键词：中药；康之源；非特异性免疫
非特异性免疫在动物疫病防控中的重要作用已得到行业广泛认可，尤其在非洲猪瘟和饲料禁抗大背景之下，猪场普遍采用中药来强化猪群非特异性免疫和提高猪群健康度，但一直以来，中药对动物非特异性免疫的影响缺乏基础数据，造成中药作用无法量化评价的窘境，本试验通过给小白鼠饲喂中药康之源，研究康之源对小白鼠非特异性免疫的影响，为中药在增强动物非特性免疫提供科学依据。
1、试验方案
1.1试验材料康之源（主要成分：刺五加、女贞子、越橘、草分枝杆菌等），由湖南加农正和生物技术有限公司提供；健康成熟雌性六周龄昆明小鼠，购自湖南斯莱克景达。1.2试验动物与设计
选用周龄（6周龄）和体重（26g±2g）一致、未经产的健康成熟雌性昆明小鼠只，预饲养1周，预饲养结束后随机分为4组，空白组饲喂基础日粮、低剂量试验组（基础日粮+0.2%康之源）、中剂量试验组（基础日粮+0.35%康之源）、高剂量试验组（基础日粮+0.5%康之源），连续饲喂28天，每组5个重复，每个重复10只，试验0-21天按照添加处理进行饲喂，从第22天起全部饲喂基础日粮，试验期28天，分别在试验开始第0、7、14、21、28天每个重复随机抽取2只小鼠处死采样。1.3饲养管理
鼠舍环境保持温湿度适宜，采用自由饮水和采食，每日于上午10：00饲喂，每日1次。1.4样品采集
血样：在小鼠禁食12小时后，于试验第0、7、14、21和28d早上8点进行称重，并在称重后用乙醚迷晕进行眼球采血，用1.5ml的EP管收集血样1.0ml左右，室温静置15min后，r/min离心10min，分离血清，-80℃保存待测；组织样品：在小鼠禁食12小时后，于试验第0、7、14、21和28d早上8点进行称重、眼球采血后断颈处死，剖腹取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺，用生理盐水冲洗表面后擦干并称重，用锡箔纸包裹好并做好标记，放入液氮中，之后转至-80℃保存待测；分离十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠，剪取小鼠各肠段中段部位的肠道组织3份，每份约2cm，其中一份放入装有甲醛的离心管中固定，室温保存待测；另外两份用生理盐水冲洗干净后，分别装入1.5mlEP管，标记后用锡箔纸包裹放入液氮中，之后转至-80℃保存待测。另外，用2ml冻存管采集盲肠和结肠内容物，标记后放入液氮中，之后转至-80℃保存待测。
2测定指标及方法
2.1血清中非特异性免疫分子溶菌酶、防御素测定
采用试剂盒ELISA方法测定小鼠血清中溶菌酶、防御素的含量。2.2血清中细胞因子检测
采用试剂盒ELISA方法进行小鼠血清IFN-β、IL-1、IL-4、IL-l0、TNF-α等种细胞因子检测。2.3小鼠肠道SIgA的检测（十二指肠，空肠，回肠，盲肠，结肠）
按试剂盒说明检测肠道SIgA水平。2.4数据统计
试验数据用Excel软件进行初步处理后，采用SPSS22.0软件的Two-wayANOVA程序进行系统方差分析，若组间差异显著，则采用Duncan氏法进行多重比较。试验结果以“平均值±标准差”表示。3、结果
3.1中药康之源对小鼠血清中细胞因子的影响
从表1可知：与空白组相比，高剂量试验组在第14天血清中IFN-β显著提高(p0.05)，低、中、高剂量组在第21天血清中IFN-β显著提高(p0.05)。表1中药康之源对小鼠血清中IFN-β的影响
从表2可知，与空白组相比，低、中、高剂量试验组第14天、第21天血清中IL-1显著下降(p0.05)，低、高剂量试验组在第28天血清中IL-1显著下降(p0.05)；低、中剂量试验组在第14天血清中TNF-α显著下降(p0.05)；低、中、高剂量试验组在第21天血清中TNF-α显著下降(p0.05)；在第28天时，中、高剂量组血清中TNF-α显著下降(p0.05)。表2中药康之源对小鼠血清中IL-1和TNF-α的影响
从表3可知，与空白组相比，中、高剂量试验组在第7天、第14天血清中IL-4显著提高(p0.05)，低剂量试验组在第21天血清中IL-4显著下降(p0.05)；中、高剂量试验组在第14天、第21天血清中IL-l0显著提高(p0.05)。表3中药康之源对小鼠血清中IL-4和IL-10的影响
3.2中药康之源对对小鼠血清中溶菌酶、防御素和十二指肠SIgA的影响
从表4数据可以看出，与空白组相比，低剂量试验组第7天血清中β-防御素2显著下降(p0.05)；低剂量试验组第14天十二指肠slgA显著提高(p0.05)；中剂量试验组第14天血清中溶菌酶显著提高(p0.05)，高剂量试验组第14天血清中溶菌酶和十二指肠slgA显著提高(p0.05)；低剂量试验组第21天血清中β-防御素2和十二指肠slgA显著提高(p0.05)；中剂量试验组第21天血清中溶菌酶、β-防御素2和十二指肠slgA显著提高(p0.05)，高剂量试验组第21天血清中溶菌酶、β-防御素2和十二指肠slgA显著提高(p0.05)。
表4中药康之源对小鼠血清中溶菌酶、防御素和十二指肠SIgA的影响
4、讨论
康之源由刺五加、女贞子和越橘等复合物采用定向发酵和结构化修饰技术而得，活性成分包括：刺五加多糖、紫丁香苷、齐墩果酸、花青素、草分枝杆菌等。
研究发现刺五加多糖（ASPS）是较理想的干扰素促诱生剂，钱农、杨吉成等人用刺五加多糖对S和S白血病细胞系以及Namalva细胞进行了干扰素诱生试验，结果表明ASPS对IFN－α、IFN－γ有促诱生效果比常规诱生组高6～7倍，郭葆玉等人用不同浓度的刺五加多糖(1～10μg/ml)对Namalwa细胞进行干扰素促诱生试验，结果显示在ASPS在1～5μg/ml范围内，促诱生效应和浓度成正相关，可使干扰素的效价提高5倍左右，尚未有刺五加多糖对小鼠血清中干扰素的研究数据，本试验结果表明，刺五加多糖可提高血清中内源性干扰素含量，与空白组具有显著性差异，诱导干扰素效应与给药剂量正相关，与之前研究结果基本相符，但增加幅度没有达到5-6倍，可能与刺五加多糖含量和细胞系不同有关。
齐墩果酸有显著的抗炎以及抗变态反应作用，这种作用主要与齐墩果酸下调炎性细胞因子和诱生型炎症介质合成酶表达，抑制炎症介质生成有关，有试验研究表明齐墩果酸可显著提高IL-1-0水平，降低IL-4水平，本试验研究数据则显示，中、高剂量前14天显著提高IL-4和IL-10水平，与之前研究结果有不一致的地方，可能与齐墩果酸含量有关。
草分枝杆菌对黏膜免疫具有良好的修复和增强功能，而且其作用与草分枝杆菌浓度有关，SIgA、防御素、溶菌酶是黏膜免疫评价主要指标，本试验中，草分枝杆菌对黏膜免疫的增强并没有呈现明显的剂量效应，还需要进一步研究。
5、结论
（1）不同剂量试验组均显著提高小鼠血清中IFN-β的含量，表明康之源具有抗病*作用，高剂量使用康之源可更快诱导产生IFN-β；
（2）不同剂量试验组均显著降低小鼠血清中IL-1、TNF-α等炎症因子的水平，同时显著提高了小鼠血清中抑炎因子（IL-4、IL-10）的浓度，说明康之源可降低小鼠体内的炎症反应，具有一定的抗炎作用；
（3）不同剂量试验组可提升小鼠血清中溶菌酶、β-防御素2的水平，从而提高了小鼠机体的非特异性免疫功能，且有一定的剂量效应；同时一定程度上提高小鼠十二指肠sIgA的含量，表明康之源可提高小鼠肠道黏膜的免疫功能。但在第28天时无显著影响，表明康之源对血清中溶菌酶、β-防御素2和十二指肠SIgA提高无延续效应。
参考文献：略本文已被第九届李曼中国养猪大会猪业博览会论文集收录，并以墙报形式在大会现场展示。▼点击视频查看PTT养猪实效学院介绍
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